หลักการและวัตถุประสงค์ : มะเร็งท่อน้ำดี เป็นมะเร็งที่เกิดจากเซลล์เยื่อบุผิวของท่อน้ำดีที่อยู่ในและนอกตับ จัดเป็นโรคมะเร็งที่มีความรุนแรงสูง มีการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี การวินิจฉัยมะเร็งในระยะเริ่มแรกมีความสำคัญต่อการมีชีวิตรอดที่ยาวนานของผู้ป่วย วัตถุประสงค์การศึกษานี้ เพื่อหาและวิเคราะห์น้ำดีด้วยเทคนิค ฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี ในการแยกสารบ่งชี้ชีวภาพของผู้ป่วยที่เป็นโรคมะเร็งท่อน้ำดีและไม่เป็นมะเร็งท่อน้ำดี

วิธีการศึกษา : โครงการวิจัยที่ผ่านการรับรองจริยธรรมในมนุษย์ (HE581251) ศึกษาน้ำดีจากอาสาสมัครด้วยฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี อาสาสมัคร เป็นผู้ป่วยแบ่งออก 2 กลุ่ม คือ กลุ่มที่ 1 ผู้ป่วยเป็นมะเร็งท่อน้ำดี 30 ราย กลุ่มที่ 2 ผู้ป่วยที่ไม่เป็นมะเร็งท่อน้ำดี แต่วินิจฉัยว่ามีนิ่วในถุงน้ำดี 30 ราย

ผลการศึกษา : สเปกตรัม ช่วงองค์ประกอบของไขมัน คลอเลสเตอรอล ฟอสโฟลิพิด และ ครีเอทีน ผู้ป่วยเป็นนิ่วและผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดีมีความแตกต่างกัน ส่วนสเปกตรัม ช่วงองค์ประกอบของบิลิรูบิน ผู้ป่วยเป็นนิ่วและผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดีไม่มีความแตกต่างกัน

สรุป : งานนี้แสดงให้เห็นความสามารถของเทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี ที่เป็นเครื่องมือในการวินิจฉัยที่แสดงความแตกต่างของสารชีวภาพจากน้ำดีในผู้ป่วยที่เป็นและไม่เป็นมะเร็งท่อน้ำดี

Methods : This study was approved by the Human Ethics Committee (HE581251). Using FTIR spectroscopy study volunteers bile. The volunteers was performed in two groups of patients. The first group consisted of 30 patients with malignant biliary strictures. The second group consisted of 30 patients without malignant biliary strictures , but diagnostic with gallstone.

บทนำ

มะเร็งท่อน้ำดี เป็นมะเร็งที่เกิดจากเซลล์เยื่อบุผิวของท่อน้ำดีที่อยู่ในและนอกตับ จัดเป็นมะเร็งที่ธรรมชาติของโรคมีความรุนแรงสูง มีการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี ผู้ป่วยมักจะมาพบแพทย์เมื่อเข้าสู่ระยะที่ลุกลามแล้ว  นิ่วในถุงน้ำดี เกิดจากภาวะไม่สมดุลของสารประกอบในน้ำดี เมื่อมีนิ่วเกิดขึ้นแล้ว อาจมีอาการตั้งแต่ ท้องอืด อาหารไม่ย่อย บางครั้งนิ่วไปอุดท่อถุงน้ำดี จะทำให้มีอาการปวด ผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งถุงน้ำดี พบว่ามีนิ่วร่วมด้วย โรคเหล่านี้พบได้ในประเทศไทย ประเทศเพื่อนบ้านใกล้เคียง และในประเทศต่างๆทั่วโลก^1–4  การรักษามะเร็งท่อน้ำดี ทำได้โดยการผ่าตัด เคมีบำบัด การฉายรังสี รวมถึง การใส่สายระบายน้ำดีผ่านทางผิวหนัง เป็นต้น^5–8  ถ้าหากสามารถตรวจพบอาการในระยะเริ่มแรกได้ ก็จะเพิ่มโอกาสในการรักษาและรอดชีวิตได้^9,10   

          ในปัจจุบันเพื่อช่วยในการวินิจฉัยและรักษาโรค ได้มีการตรวจทางห้องปฏิบัติการด้วยวิธีการทางอิมมูโนวิทยา ตรวจหาสารบ่งชีทางชีวภาพ (biomarkers) ต่างๆในกระแสเลือด เช่น carcinoembryonic antigen (CEA) หรือ cancer antigen (CA) 19-9 หรือ Interleukin-6 (IL-6) หรือ  mucin-5AC แต่วิธีการเหล่านี้ ก็ยังไม่มีความจำเพาะต่อโรคมะเร็ง^11–17 

น้ำดี ประกอบด้วย กรดน้ำดี คอเลสเตอรอล ฟอสโฟลิพิด กรดน้ำดี คือ อนุพันธ์ของโคเลสเตอรอลที่ร่างกายสังเคราะห์ขึ้นที่ตับ น้ำดีถูกลำเลียงผ่านออกมาทางท่อน้ำดีตับ (bile duct)¹⁸  น้ำดีที่พักไว้ในถุงไหลลงสู่ระบบน้ำดีเข้าสู่ทางเดินอาหารเพื่อย่อยสลายอาหาร ใช้ในกระบวนการดูดซึมไขมันและวิตามินที่ละลายในไขมัน^19,20  น้ำดีมีบทบาทในการสื่อสัญญาณเซลล์ หากเกิดการอุดตันของท่อน้ำดี มีการคั่งของน้ำดี น้ำดีมีการอักเสบ หรือการเป็นมะเร็งท่อน้ำดี องค์ประกอบของน้ำดีจะมีการเปลี่ยนแปลง²¹

เทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี (Fourier Transform Infrared Spectroscopy ; FTIR) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการวิเคราะห์สารประกอบชีวเคมีที่แสดงออกมาในลักษณะของสเปกตรัมที่แตกต่างกัน โดยอาศัยการเกิดอันตรกิริยา (interaction) ระหว่างวัตถุกับคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าในย่านอินฟราเรด เมื่อปลดปล่อยคลื่นแม่เหล็กไปกระทบกับวัตถุ จะทำให้เกิดการดูดกลืน หักเห ทะลุผ่านในนิวเคลียสเหล่านี้มีสมบัติทางเคมีที่ต่างกัน เนื่องจากเป็นเครื่องที่มีประสิทธิภาพในการวิเคราะห์ ไวต่อการเปลี่ยนแปลงต่อองค์ประกอบโมเลกุล  การใช้ตัวอย่างเพียงเล็กน้อยในการตรวจและมีกลไกการทำงานที่ง่ายอีกด้วย^22,23  ผู้วิจัยจึงมีความสนใจที่จะศึกษาผลจากการวิเคราะห์น้ำดีด้วยเทคนิค FTIR เพื่อวิเคราะห์และศึกษาสเปกตรัมของน้ำดีและหาสารบ่งชี้ชีวภาพของผู้ป่วยที่เป็นโรคมะเร็งท่อน้ำดีและไม่เป็นมะเร็งท่อน้ำดี เพื่อเป็นแนวทางในการวินิจฉัยโรคและรักษาโรคต่อไป

วิธีการศึกษา

การเก็บตัวอย่างน้ำดีจากอาสาสมัคร

การศึกษาครั้งนี้นำน้ำดีจากอาสาสมัคร ณ โรงพยาบาลศรีนครินทร์ คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น รายละ 1 -2 มิลลิลิตร จำนวน 60 ราย จากการโครงการวิจัยที่ผ่านการรับรองจริยธรรมในมนุษย์ (HE581251) อาสาสมัคร แบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม กลุ่มที่ 1 จำนวน 30 ราย ได้รับการบริจาคน้ำดีจากอาสาสมัครที่ป่วยเป็นมะเร็งท่อน้ำดี ที่ผ่านการตรวจว่าเป็นมะเร็งท่อน้ำดี ด้วยการตรวจชิ้นเนื้อ หรือ ตรวจวินิจฉัยด้วยเครื่องสร้างภาพทางการแพทย์ ได้แก่ เครื่องสร้างภาพเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ (computed tomography) เครื่องสร้างภาพเอ็มอาร์ (magnetic resonance image) และเข้ารับการตรวจด้วยการใส่สายระบายน้ำดีผ่านทางผิวหนัง (percutaneous transhepatic biliary drainage; PTBD) กลุ่มที่ 2 จำนวน 30 ราย ได้รับการบริจาคน้ำดีจากอาสาสมัครที่ไม่เป็นมะเร็งท่อน้ำดี แต่เป็นนิ่วในถุงน้ำดี ที่ผ่านการตรวจรังสีวินิจฉัยด้วยการส่องกล้อง (retrograde cholangiopancreatography; ERCP) โดยจะเก็บน้ำดีจากอาสามาสมัคร ก่อนที่จะมีการฉีดสารทึบเปรียบต่าง (contrast media) เข้าสู่ท่อน้ำดี และจะนำน้ำดีของอาสามสมัครใส่หลอดทดลอง ปิดพาราฟินนำไปแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80 องศาเซลเซียส และ ก่อนการศึกษา จะนำน้ำดีออกมาจากตู้แช่ รอจนน้ำดีละลายที่อุณหภูมิห้อง

การวิเคราะห์น้ำดีด้วยเทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี

ทุกครั้งก่อนหยดตัวอย่างน้ำดีลงบนหัววัด (Diamond ATR crystal detector) ของเครื่องวิเคราะห์ฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี  (Agilent technologies รุ่น 4,500a FTIR) จะทำความสะอาดหัววัด โดยใช้กระดาษแห้งเช็ดคราบสกปรก จากนั้นจะเช็ดซ้ำด้วยน้ำสะอาด และเมทานอล แล้วปล่อยให้หัววัดแห้ง น้ำดีจากอาสาสมัครแต่ละคน จะนำมาวิเคราะห์ จำนวน 3 ครั้ง แต่ละครั้งใช้น้ำดี ประมาณ 3 ไมโครลิตร โดยหยดน้ำดีลงบนหัววัด น้ำดีที่ทำการศึกษาจะมี 2 แบบ คือ (1) แบบตัวอย่างเปียก (wet sample) (2) แบบตัวอย่างแห้ง (dry sample) โดยศึกษาจากตัวอย่างน้ำดีแบบเปียกก่อน แล้วบันทึกข้อมูลเข้าสู่คอมพิวเตอร์ เมื่อเก็บข้อมูลเรียบร้อยแล้ว  ใช้เครื่องเป่าผม เป่าให้ลมผ่านเหนือตัวอย่างน้ำดีเปียก เป็นเวลา  7 นาที จะได้น้ำดีแห้ง จากนั้นบันทึกข้อมูล (รูปที่ 1 และ 2)

รูปที่ 1 แสดงลำดับการนำน้ำดีของอาสาสมัครมาผ่านขั้นตอนการดำเนินการด้วยเทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี และปรับแต่งสเปกตรัม ก่อนนำข้อมูลไปวิเคราะห์

รูปที่ 2 ตัวอย่างสเปกตรัม ช่วงตั้งแต่ 4,000 -800 ซม^-1 สเปกตรัมของน้ำดีตัวอย่างแบบเปียก ( ÿ ) และ ตัวอย่างแบบแห้ง ( X )

รูปที่ 3 บางส่วนของสเปกตรัม ระหว่าง 4,000 – 800 ซม^-1 ของน้ำดีกลุ่มอาสาสมัคร ผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดี ผ่านการตรวจจาก PTBD และ ผู้ป่วยเป็นนิ่ว ผ่านการตรวจจาก ERCP ศรชี้ ช่วงองค์ประกอบของคลอเลสเตอรอล ฟอสโฟลิพิด และ ครีเอทีน

รูปที่ 4 เปรียบเทียบสเปกตรัมเฉลี่ย ระหว่าง 3,700 – 3,200 ซม^-1 เป็นช่วงองค์ประกอบของโปรตีน (protein) และ สเปกตรัมระหว่าง 3,000 – 2,800 ซม^-1 เป็นช่วงองค์ประกอบของ คลอเลสเตอรอล (Cholesterol) ฟอสโฟลิพิด (phospholipids) และ ครีเอทีน (creatine) ของน้ำดีอาสาสมัคร ผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดี ผ่านการตรวจจาก PTBD และ ผู้ป่วยเป็นนิ่ว ผ่านการตรวจจาก ERCP

การวิเคราะห์ข้อมูล

ข้อมูลที่บันทึกไว้ทั้งหมด จะนำมาวิเคราะห์โดยใช้โปรแกรม  The Unscrambler^® X (version 10.3, CAMO, Oslo, Norway) เพื่อหาสารบ่งชี้ชีวภาพที่มีในน้ำดีของอาสาสมัครทั้ง 2 กลุ่ม เมื่อได้ข้อมูลมาแล้ว จะทำการแปลงข้อมูลสเปกตรัมด้วยอนุพันธ์อันดับที่สอง (second derivative transform) เพื่อทำให้สามารถแยกพีคที่มีการซ้อนทับกันออกจากกัน จากนั้นจะทำการบีบอัดสเปกตรัมทั้งหมดในแต่ละกลุ่ม ด้วยเทคนิคการปรับแก้การกระเจิงแบบผลคูณ (multiplicative scatter correction transform; MSC/EMSC) เพื่อให้ได้สเปคตรัมเฉลี่ย และใช้โปรแกรม Wilcoxon Signed Ranks Test เพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างสารบ่งชี้ชีวภาพที่มีในน้ำดีของอาสาสมัครทั้ง 2 กลุ่ม

ผลการศึกษา

การวิเคราะห์สเปกตรัมของน้ำดีของอาสาสมัครที่เป็นมะเร็งท่อน้ำดีและเป็นนิ่วในถุงน้ำดี ด้วยเทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี ผลการศึกษานี้ โดยแสดงสเปกตรัม ตั้งแต่ 4,000 -800 ซม^-1 พบว่า สเปกตรัมของน้ำดีตัวอย่างแบบเปียก และ ตัวอย่างแบบแห้ง สเปกตรัมมีความแตกต่างกัน ในสเปกตรัมของน้ำดีแบบเปียก น้ำดีที่มีน้ำเป็นส่วนประกอบจะพบพีค (peak) ของน้ำ ในปริมาณสูง จนทำให้บดบังพีคของสารที่เป็นส่วนประกอบของน้ำดีอื่นๆ ส่วนสเปกตรัมของน้ำดีแบบแห้ง ใช้ลมร้อนไล่น้ำที่อยู่ในน้ำดีออกไป ทำให้พบพีคของสารอื่นๆที่เป็นส่วนประกอบของน้ำดีปรากฏชัดเจนขึ้น สำหรับสเปกตรัม ระหว่าง 3,700 – 3,200 ซม^-1 เป็นช่วงองค์ประกอบของโปรตีน (protein) และ สเปกตรัม ระหว่าง 3,000 – 2,800 ซม^-1 เป็นช่วงองค์ประกอบของไขมัน (lipid) คลอเลสเตอรอล (Cholesterol) ฟอสโฟลิพิด (phospholipids) และ ครีเอทีน (creatine)^24–26 พบว่า สเปกตรัม 3,000 – 2,800 ซม.^-1 ผู้ป่วยเป็นนิ่วและผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดีมีความแตกต่างกันอย่างชัดเจน (p<0.000) ส่วนสเปกตรัม ระหว่าง 1,700 – 1,500 ซม.^-1 เป็นช่วงองค์ประกอบของบิลิรูบิน (Bilirubin)^27,28 ผู้ป่วยเป็นนิ่วและผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดีไม่มีความแตกต่างกัน (p=1.000) (ตารางที่ 1) โดย p<0.05* แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ

วิจารณ์

จากการศึกษาโดยใช้เทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี แสดงสเปกตรัมของน้ำดีจากผู้ป่วยมะเร็งท่อน้ำดีและผู้ป่วยนิ่วในถุงน้ำดีมีความแตกต่างกัน โดยเฉพาะในส่วนสเปกตรัมที่เป็นส่วนของคอเลสเตอรอล ที่เป็นองค์ประกอบของน้ำดีและไขมัน ซึ่งไขมันเป็นหนึ่งในองค์ประกอบที่จำเป็นในการควบคุมการทำงานของเซลล์และสภาวะสมดุล และตับมีบทบาทสำคัญในการเผาผลาญไขมันในหลายขั้นตอนของการสังเคราะห์ไขมันและการขนส่ง ดังนั้นในผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งท่อน้ำดีที่มีความผิดปกติในท่อน้ำดีและตับ ตับอยู่ในภาวะที่บกพร่อง จึงทำให้การสังเคราะห์คอเลสเตอรอลลดลง²⁹ การศึกษานี้สอดคล้องกับ  Nagana และคณะ ทำการศึกษาน้ำดีผู้ป่วยมะเร็งตับด้วยเทคนิคนิวเคลียร์แมกเนติกรีโซแนซสเปกโทรสโกปี (nuclear magnetic resonance spectroscopy) พบว่า มีการลดลงของคอเลสเตอรอลและฟอสโฟลิพิด ³⁰ มะเร็งท่อน้ำดี เป็นโรคมีความรุนแรงสูง มีการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี จากการศึกษานี้สามารถใช้เทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี แสดงให้เห็นว่าสารบ่งชี้ชีวภาพ คือ ปริมาณของคอเลสเตอรอล ของผู้ป่วยที่เป็นโรคมะเร็งท่อน้ำดี มีการลดลง เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยที่ไม่เป็นมะเร็งท่อน้ำดี ที่สามารถแสดงจากสเปกตรัม ช่วง 3,000 – 2,800 ซม^-1 การตรวจสารชีวภาพที่มีน้ำเป็นส่วนประกอบจะพบพีค (peak) ของน้ำ ในสเปกตรัมจะบดบังพีคของสารที่เป็นส่วนประกอบอื่นๆ ในการศึกษานี้ได้ใช้ลมร้อนไล่น้ำที่อยู่ในน้ำออกไป ทำให้พบพีคของสารอื่นๆที่เป็นส่วนประกอบของน้ำดีปรากฏชัดเจนขึ้น

สรุป

เทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี เป็นเทคนิคใช้ระยะเวลาในการตรวจหาสารบ่งชี้ชีวภาพที่สั้น ได้ผลการตรวจที่รวดเร็ว เป็นทางเลือกหนึ่งที่สามารถนำใช้ประกอบการวินิจฉัยโรคต่อไป

กิตติกรรมประกาศ

งานศึกษาครั้งได้รับทุนสนับสนุนการวิจัยจากคณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น (เลขที่โครงการ IN58315) คณะผู้วิจัยขอขอบพระคุณอาสาสมัครที่มอบน้ำดี เพื่อนำมาใช้ศึกษา และ คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น ที่ให้ความอนุเคราะห์ใช้เครื่องมือในการตรวจวิเคราะห์ด้วยเทคนิคฟูเรียร์ทรานฟอร์มอินฟราเรดสเปกโทรสโกปี รวมถึงเครื่องมืออุปกรณ์ประกอบอื่นๆการศึกษา ครั้งนี้