Untitled Document
 
 
 
 
Untitled Document
Home
Current issue
Past issues
Topic collections
Search
e-journal Editor page

Population genetics of Plasmodium vivax in Saiyok District, Kanchanaburi Province : A Comparative Study Case between the Years 2010 and 2013-2014

พันธุศาสตร์ประชากรเชื้อมาลาเรียชนิด Plasmodium vivax ที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี :กรณีศึกษาเปรียบเทียบระหว่างปี พ.ศ. 2553 และ พ.ศ. 2556-2557

Kanungnit Congpuong (คนึงนิจ คงพ่วง) 1, Ratawan Ubalee (รตวรรณ อุบาลี) 2, Ekkachai Khamfan (เอกชัย คำฝั้น) 3




หลักการและวัตถุประสงค์ : ปัจจุบันสถานการณ์ของชนิดเชื้อมาลาเรียเปลี่ยนแปลงไป ที่จังหวัดกาญจนบุรีมีผู้ป่วยมาลาเรียชนิด P. vivax มากกว่าชนิด P. falciparum วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อเปรียบเทียบลักษณะพันธุกรรมของประชากร P. vivax ในอำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรีซึ่งเป็นพื้นที่ที่มีโรคมาลาเรียชุกชุม ในสองช่วงเวลาคือปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557

วิธีการศึกษา : เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 และ PV3.502 ของ P. vivax ด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส เปรียบเทียบขนาดของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ของแต่ละตัวอย่างด้วยการวิเคราะห์ขนาดของชิ้นส่วน

ผลการศึกษา : ประชากรเชื้อมาลาเรียของสองช่วงเวลามีความหลากหลายของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ที่ใช้ตรวจสูงมากและแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ โดยประชากรปี พ.ศ. 2556-2557 มีความหลากหลายทางพันธุกรรมมากกว่าประชากรปี พ.ศ. 2553 ค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้ของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ที่ตำแหน่ง PV3.27 ของประชากรปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 เท่ากับ 0.898 และ 0.927 และค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้ของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ที่ตำแหน่ง PV3.502 ของประชากรปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 เท่ากับ 0.873 และ 0.912 ตามลำดับ ค่าเฉลี่ยการติดเชื้อพร้อมกันหลายโคลนของประชากร P. vivax ที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรีมีอัตราสูงถึงร้อยละ 52.1 โดยปี พ.ศ. 2553 พบร้อยละ 54.8 และปี พ.ศ. 2556-2557 พบร้อยละ 48.4 ค่าเฉลี่ยจำนวนโคลนที่ติดเชื้อในกลุ่มที่มีการติดเชื้อมากกว่าหนึ่งโคลนเท่ากับ 2.35, 2.38 และ 2.45 สำหรับเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27, PV3.502 และรวมทั้งสองเครื่องหมาย ตามลำดับ

สรุป : ประชากรเชื้อ P. vivax ที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรีในปี พ.ศ. 2556-2557 มีความหลากหลายเพิ่มขึ้นจากปี พ.ศ. 2553 แสดงถึงยังคงมีการแพร่เชื้อในพื้นที่สูงและมีวิวัฒนาการของเชื้อมาลาเรียชนิดนี้

 

Background and Objective: In Kanchanaburi province, malaria caused by Plasmodium (P) vivax has increased in higher proportion compared to P. falciparum but little is known about genetic structure of P. vivax in this area. This study aimed to compare genetic characteristics of P. vivax isolates collected from malaria patients in Saiyok district of Kanchanaburi province in year 2010 and years 2013-2014.

Material and Methods: Two microsatellite markers, i.e. PV3.27 and PV3.502 were amplified by nested polymerase chain reaction, followed by fragment analysis of PCR products.

Result: P. vivax population of years 2013-2014 had statistical significance higher in genetic diversity than population of year 2010. Expected heterozygosity values of microsatellite marker, PV3.27 of year 2010 and 2013-2014 were 0.898 and 0.927; those values of PV3.502 were 0.873 and 0.912, respectively. Polyclonal infection of P. vivax population in Saiyok district, Kanchanaburi province was high. The average polyclonal infections were 52.1%; 54.8% in 2010 and 48.4% in 2013-2014. Mean multiplicity of infection was 2.35, 2.38, and 2.45 for microsatellite markers, PV3.27, PV3.502, and the combination, respectively.

Conclusion: P. vivax population in Saiyok district, Kanchanaburi province had increase in genetic diversity when compared between isolates collected in year 2010 and year 2013-2014. This suggests that there is still high malaria transmission and parasite evolution in this area.   

 

บทนำ

การแพร่เชื้อมาลาเรียในประเทศไทยเป็นการแพร่เชื้อตามฤดูกาลและมีการระบาดเป็นครั้งคราว อัตราการเกิดโรคมาลาเรียต่อประชากรพันคน (annual parasite incidence: API) เท่ากับ 0.37 ในปี พ.ศ. 2557 ตั้งแต่ปีงบประมาณ พ.ศ. 2543 ผู้ป่วยส่วนใหญ่ร้อยละ 46.71 ติดเชื้อมาลาเรียชนิด Plasmodium vivax ในปี พ.ศ. 2557 จังหวัดกาญจนบุรีพบผู้ป่วยมากเป็นอันดับ 8 ของประเทศ พบผู้ป่วย 639 รายลดลงจากปี พ.ศ. 2556 ซึ่งพบผู้ป่วยจำนวน 1,245 ราย1

จากการที่ปัจจุบันสถานการณ์ของชนิดเชื้อมาลาเรียเปลี่ยนแปลงไป โดยมีผู้ป่วยมาลาเรียชนิด P. vivax เพิ่มขึ้นมาก ทำให้จำเป็นต้องมีการศึกษาวิจัยเกี่ยวกับการติดเชื้อมาลาเรียชนิดนี้มากขึ้น เพราะที่ผ่านมาการวิจัยเน้นไปที่เชื้อมาลาเรียชนิด P. falciparum มากกว่าเนื่องจากเป็นสาเหตุของการเกิดโรคมาลาเรียชนิดรุนแรงและมีอาการแทรกซ้อน ทำให้มีการศึกษากันมากทั้งเรื่องประสิทธิภาพของยาชนิดต่าง ๆ ที่ใช้รักษา เครื่องหมายโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยา และความแตกต่างทางพันธุศาสตร์ประชากรของ P. falciparum ในพื้นที่ต่าง ๆ ของประเทศ แต่การศึกษาเกี่ยวกับ P. vivax ยังมีน้อย โดยเฉพาะการศึกษาด้านพันธุศาสตร์ประชากร

ในช่วงระยะเวลา 2 ปีที่ผ่านมาสถานการณ์โรคมาลาเรียที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรีพบมีเชื้อมาลาเรียชนิด P. vivax เพิ่มขึ้นมากกว่า P. falciparum ร้อยละของผู้ป่วย P. vivax เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องคือ ร้อยละ 33.2, 38.3, 39.1 และ 52.9 ในปี พ.ศ. 2553-2556 ตามลำดับ นอกจากนี้ยังมีรายงานการดื้อยาของ P. vivax ต่อยาคลอโรควินเกิดขึ้นที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี2 ความเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นนี้ส่วนหนึ่งอาจเป็นผลมาจากมีการเปลี่ยนแปลงลักษณะทางพันธุกรรมของ P. vivax การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความแตกต่างของลักษณะทางพันธุกรรมของ P. vivax จากตัวอย่างเลือดผู้ป่วยติดเชื้อมาลาเรียในอำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรีเปรียบเทียบระหว่างปี พ.ศ. 2553 และ ปี พ.ศ. 2556-2557

วิธีการศึกษา

ประชากรศึกษาเป็นเชื้อมาลาเรียชนิด P. vivax ได้จากผู้ป่วยมาลาเรียชนิดเฉียบพลันที่ไม่มีอาการแทรกซ้อน ติดเชื้อมาลาเรียชนิด P. vivax เพียงชนิดเดียว เป็นผู้ป่วยที่มารับบริการตรวจรักษาโรคมาลาเรียที่หน่วยควบคุมโรคติดต่อนำโดยแมลงที่ 4.1.4 ตำบลลุ่มสุ่ม อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี ตัวอย่างที่ได้แบ่งเป็น 2 กลุ่ม คือกลุ่มแรกเป็น P. vivax ที่ได้จากผู้ป่วยระหว่างปี พ.ศ. 2553 และกลุ่มที่สองได้จากผู้ป่วยระหว่างปี พ.ศ. 2556-2557

ตัวอย่างที่นำมาศึกษาเป็นตัวอย่างเลือดเก็บบนกระดาษกรอง การเก็บตัวอย่างทำโดยหยดเลือดผู้ป่วยที่มีเชื้อมาลาเรียชนิด P. vivax ลงบนกระดาษกรอง Whatman 3MM ขนาดของหยดเลือดมีเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 1 ซม. รอจนเลือดแห้งสนิทเอง ห้ามใช้ความร้อนทำให้หยดเลือดแห้ง เก็บใส่ซองพลาสติกที่มีสารกันชื้น ปิดซองให้สนิท เลือดบนกระดาษกรองนำมาสกัดดีเอ็นเอใช้ตรวจหาเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ของ P. vivax ที่ห้องปฏิบัติการวิจัยชีวโมเลกุล คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏบ้านสมเด็จเจ้าพระยา

ดีเอ็นเอที่สกัดได้นำมาตรวจหาเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ด้วยวิธี nested polymerase chain reaction โดยใช้ไพรเมอร์ และ สีฟลูออเรสเซนต์ที่ใช้ติดฉลากไพรเมอร์ ในการวิเคราะห์เครื่องหมายไมโคร แซทเทลไลท์ PV3.27 และ PV3.502 ใช้ไพรเมอร์ตามวิธีของ Imwong และคณะ3 แต่เปลี่ยนสีฟลูออเรสเซนต์เป็นสี PET แทน (ตารางที่ 1)

 

ตารางที่ 1      เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ ตำแหน่งบนโครโมโซม ไพรเมอร์ที่ใช้ตรวจ และขนาดคู่เบสของชิ้นส่วนปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส

เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์

ลำดับเบสซ้ำ

ไพรเมอร์  (5’ ไป 3’)

โครโมโซมที่

ขนาดคู่เบส (ช่วง)

PV3.27

AAAC

F:        AAGCTGCACTGAATTATGCT

R:        TTCCAAATGTATGTGCAGTC

F:PET-  AGCACAAGCATATGCAAAA

3

128

(85-240)

PV3.502

AACGGATG

F:         CCATGGACAACGGGTTAG

R:        TCCTACTCAGGGGGAATACT

F:PET- GTGGACCGATGGACCTAT

3

168

(128-265)

 

เมื่อได้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากการเพิ่มจำนวนด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแล้วนำไปวิเคราะห์ขนาด ด้วยการทำ แคปิลลารี่อิเล็กโทรโฟรีซีส (capillary electrophoresis) วัดขนาดของชิ้นส่วนด้วยการเทียบกับดีเอ็นเอขนาดมาตรฐานที่ติดฉลากสีฟลูออเรสเซนต์ ในการศึกษานี้การแยกขนาดชิ้นส่วนดีเอ็นเอใช้การตรวจด้วยเครื่อง Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer; Applied Biosystems, Foster City, CA) อ่านผลด้วยโปรแกรมสำเร็จรูป GeneMapper® v4.0 analysis (Applied Biosystem, Foster city, California, USA)

การวิเคราะห์ข้อมูลประกอบด้วยสองส่วนคือ 1) การวิเคราะห์ว่าประชากรเชื้อทั้งสองกลุ่มมีความหลากหลายทางพันธุกรรมแตกต่างกันหรือไม่ และ 2) การทดสอบว่าความแตกต่างที่พบมีนัยสำคัญทางสถิติหรือไม่ ในส่วนที่หนึ่งประกอบด้วย 1.1) การวิเคราะห์ความถี่อัลลีล (allele frequency) โดยความถี่ของอัลลีลแต่ละชนิดของแต่ละเครื่องหมายได้จากการนับจำนวนอัลลีลแต่ละชนิด สร้างกราฟแท่งแสดงการกระจายความถี่อัลลีลแต่ละชนิดของประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 การศึกษานี้ใช้เฉพาะอัลลีล หลักในการหาค่าความถี่อัลลีล 1.2) ค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้ (expected heterozygosity; HE) ใช้บอกความหลากหลายทางพันธุกรรมของยีนระหว่างประชากร โดยจะบอกว่าโอกาสที่อัลลีลสองอัลลีลที่ได้จากตัวอย่างจากการสุ่มจากประชากรมีความแตกต่างกันหรือไม่ ค่า HE อยู่ระหว่าง 0 ถึง 1 ค่าที่เข้าใกล้ 1 แสดงถึงมีความหลากหลายของประชากรกลุ่มนั้นมาก ค่า HE  ได้จากการคำนวณโดยใช้โปรแกรม GenAlEx 6.54 และ 1.3) ค่าเฉลี่ยจำนวนโคลนของการติดเชื้อพร้อมกันหลายโคลน (multiplicity of infection: mean MOI) เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ที่ศึกษาเป็นเครื่องหมายที่มีเพียงสำเนาเดียวและเชื้อมาลาเรียระยะที่อยู่ในกระแสเลือดเป็นแฮพลอยด์ (haploid) ดังนั้นการพบอัลลีลมากกว่าหนึ่งอัลลีลในแต่ละเครื่องหมายจึงหมายถึงมีการติดเชื้อแบบผสมจีโนไทป์หรือแบบหลายโคลน (mixed-genotype หรือ mixed-clone infection) การติดเชื้อหลายโคลนพร้อมกันเป็นตัวชี้วัดระดับการแพร่เชื้อในประชากร ค่า MOI คือจำนวนอัลลีลที่มากที่สุดของเครื่องหมายที่พบจำนวนอัลลีลมากที่สุด หาค่า MOI ของประชากร P. vivax สองกลุ่มคือประชากรเชื้อในปี พ.ศ. 2553 และ ประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2556-2557 เปรียบเทียบค่า MOI ของประชากรเชื้อสองกลุ่มนี้โดยใช้ Mann-Whitney U test

2) การวัดความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติของความหลากหลายทางพันธุกรรมของประชากรสองกลุ่มใช้ Shannon Analysis โดยการหาค่า Shannon’s mutual information index (SHUA) จากค่า  SHUA สามารถเปลี่ยนเป็น log-likelihood contingency test G statistic ซึ่งเป็นสถิติไคสแควร์ที่ใช้ทดสอบความแตกต่างของความถี่อัลลีลของตัวอย่างจากแต่ละคู่ของกลุ่มประชากร กำหนดระดับนัยสำคัญทางสถิติที่ p < 0.05

 

ผลการศึกษา

การวิเคราะห์ข้อมูลได้เลือกเฉพาะตัวอย่างที่สามารถตรวจพบไมโครแซทเทลไลท์ทั้งสองเครื่องหมายซึ่งมีจำนวนตัวอย่างรวม 73 ตัวอย่าง เป็นตัวอย่างประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2553 จำนวน 42 ตัวอย่าง และเป็นตัวอย่างประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2556-2557 จำนวน 31 ตัวอย่าง การวิเคราะห์ข้อมูลจะวิเคราะห์จากอัลลีลหลัก (predominant allele) ส่วนจำนวนอัลลีลทั้งหมดคืออัลลีลหลักและอัลลีลรองจะนำไปวิเคราะห์การติดเชื้อพร้อมกันหลายโคลน (multiplicity of infection)

ประชากรเชื้อในปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 มีความหลากหลายของอัลลีลสูง จำนวนอัลลีลที่แตกต่างกันของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 และ PV3.502 เท่ากับ 12 และ 14 สำหรับประชากรเชื้อในปี พ.ศ. 2553 และเท่ากับ 13 และ 12 สำหรับประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2556-2557 เมื่อคำนวณเป็นจำนวนอัลลีลต่อเครื่องหมาย (allele per locus หรือ allelic richness) เท่ากับ 13 และ 12.5 อัลลีลต่อเครื่องหมายตามลำดับ

ที่เครื่องหมาย PV3.27 ของกลุ่มตัวอย่างปี พ.ศ. 2553 อัลลีลที่พบมากที่สุด 5 อันดับแรกคือ อัลลีลที่มีขนาด 101, 121, 105, 109 และ 113 คู่เบส โดยพบร้อยละ 16.7, 16.7, 14.3, 14.3 และ 11.9 ตามลำดับ (รูปที่ 1) รวมเป็นร้อยละ 73.9 ของตัวอย่างทั้งหมด ส่วนตัวอย่างปี พ.ศ. 2556-2557 อัลลีลที่พบมากที่สุด 5 อันดับแรกคืออัลลีลขนาด 117, 97, 121, 105 และ 113 คู่เบสโดยพบร้อยละ 19.4, 12.9, 12.9, 9.7 และ 9.7 ตามลำดับ รวมเป็นร้อยละ 64.6 ของตัวอย่างทั้งหมด ที่น่าสังเกตคือที่ตำแหน่ง 101 พบเป็นของเชื้อปี พ.ศ. 2553 มากกว่าเชื้อปี พ.ศ. 2556-2557 มาก ในขณะที่ตำแหน่ง 117 กลับพบเป็นของเชื้อปี พ.ศ. 2556-2557 มากกว่า อย่างไรก็ตามเมื่อทดสอบความแตกต่างของความถี่อัลลีลโดยใช้สถิติ G test ไม่พบความแตกต่างของความถี่อัลลีลของประชากรเชื้อกลุ่มปี พ.ศ. 2553 และ กลุ่มปี พ.ศ. 2556-2557 โดยมีค่า G เท่ากับ 27.2 DF เท่ากับ 17 และ Chi square probability เท่ากับ 0.055

 

รูปที่ 1 ความถี่อัลลีลของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27

 

ความถี่อัลลีลของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.502 (รูปที่ 2) ของกลุ่มตัวอย่างปี พ.ศ. 2553 อัลลีลที่พบมากที่สุด 4 อันดับแรกคือ อัลลีลขนาด 152, 192, 168 และ 144 คู่เบสโดยพบร้อยละ 26.2, 19, 14.3 และ 9.5 ตามลำดับ รวมเป็นร้อยละ 69 ของตัวอย่างทั้งหมด ส่วนกลุ่มตัวอย่างปี พ.ศ. 2556-2557 อัลลีลที่พบมากที่สุด 4 อันดับแรก คือ อัลลีลขนาด 160, 136, 208 และ 176 โดยพบร้อยละ 22.6, 12.9, 12.9 และ 9.7 ตามลำดับ รวมเป็นร้อยละ 58.1 ของตัวอย่างทั้งหมด ที่น่าสังเกตคือที่ตำแหน่ง 152 และ 192 พบเป็นเชื้อของปี พ.ศ. 2553 มากกว่าเชื้อปี พ.ศ. 2556-2557 มาก ในทางตรงกันข้ามที่ตำแหน่ง 160 และ 208 กลับพบเป็นเชื้อปี พ.ศ. 2556-2557 มากกว่า เมื่อทดสอบความแตกต่างของความถี่อัลลีลระหว่างประชากรเชื้อในปี พ.ศ. 2553 และ ปี พ.ศ. 2556-2557 โดยสถิติ G test พบมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติโดยมีค่า G เท่ากับ 48.607 DF เท่ากับ 16 และ Chi square probability <0.0001

 

 

รูปที่ 2 ความถี่อัลลีลของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.502

 

การติดเชื้อมากกว่าหนึ่งสายพันธุ์พร้อมกัน (multiplicity of infection)

การติดเชื้อมากกว่าหนึ่งสายพันธุ์พร้อมกัน (multiplicity of infection: MOI) คำนวณแยกแต่ละเครื่องหมายและรวมทั้งสองเครื่องหมายแสดงในตารางที่ 2 ค่า MOI ของเครื่องหมาย PV3.27 เท่ากับ 2.35 เครื่องหมาย PV3.502 เท่ากับ 2.38 เมื่อรวมทั้งสองเครื่องหมาย ค่า MOI เท่ากับ 2.45 (ตารางที่ 2)

 

ตารางที่ 2      การติดเชื้อมากกว่าหนึ่งสายพันธุ์พร้อมกันของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 และ PV3.502 ของประชากรเชื้อ P. vivax ที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี

เครื่องหมาย

จำนวนตัวอย่างที่มีการติดเชื้อ 1-6 ชนิดพร้อมกัน

MOI

1

2

3

4

6

PV3.27

PV3.502

รวม

56 (76.7)

39 (53.4)

35 (47.9)

12 (16.4)

26 (35.6)

27 (37.0)

4 (5.5)

5 (6.9)

7 (9.6)

1 (1.4)

2 (2.7)

3 (4.1)

0

1 (1.4)

1 (1.4)

2.35

2.38

2.45

จำนวนในเครื่องหมายวงเล็บคือค่าร้อยละ

พารามิเตอร์ที่แตกต่างกันระหว่างประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2553 และ ปี พ.ศ. 2556-2557 อีกพารามิเตอร์หนึ่ง คือ การติดเชื้อพร้อมกันมากกว่าหนึ่งโคลนในการติดเชื้อแต่ละครั้ง (multiplicity of infection: MOI) พบว่าประชากรปี พ.ศ. 2553 มีการติดเชื้อมากกว่าหนึ่งโคลนมากกว่าประชากรปี พ.ศ. 2556-2557 เมื่อใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 โดยมีร้อยละของการติดเชื้อมากกว่าหนึ่งโคลนในประชากรปี พ.ศ. 2553 และ ปี พ.ศ. 2556-2557 เท่ากับร้อยละ 38.1 และ 3.2 ตามลำดับ แต่เมื่อใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.502 พบร้อยละของการติดเชื้อมากกว่าหนึ่งโคลนใกล้เคียงกัน คือ ร้อยละ 42.9 และ 51.6 ตามลำดับ (ตารางที่ 3) การติดเชื้อมากกว่าหนึ่งโคลนของประชากรปี พ.ศ. 2553 มากกว่าประชากรปี พ.ศ. 2556-2557 เล็กน้อย โดยมีร้อยละของการติดเชื้อมากกว่าหนึ่งโคลนเท่ากับร้อยละ 54.8 และ ร้อยละ 48.4 ตามลำดับ แต่ความแตกต่างนี้ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (p = 0.174)

 

ค่าเฉลี่ยเฮเทอโรไซโกซิตี้คาดหวัง (Expected heterozygosity; HE) ของประชากรปี พ.ศ. 2553 ทั้งสองเครื่องหมายมีค่าน้อยกว่าของประชากรปี พ.ศ. 2556-2557 โดยมีค่า  HE ของเครื่องหมาย PV3.27 และ PV3.502 ของประชากรปี พ.ศ. 2553 เท่ากับ 0.898 และ 0.873 ตามลำดับ และเท่ากับ 0.925 และ 0.912 ตามลำดับสำหรับประชากรปี พ.ศ. 2556-2557 เมื่อคำนวณรวมทั้งสองเครื่องหมายก็ยังพบว่าประชากรเชื้อในปี พ.ศ. 2556-2557 มีความหลากหลายสูงกว่าประชากรเชื้อในปี พ.ศ. 2553 คือมีค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้เท่ากับ 0.886 (SE = 0.012) และ 0.918 (SE = 0.006) ในปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 ตามลำดับ (ตารางที่ 3) เมื่อรวมทั้งสองเครื่องหมายและรวมประชากรทั้งสองกลุ่มมีค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้เท่ากับ 0.902 (SE = 0.011) (ตารางที่ 3)

 

ตารางที่ 3    ความหลากหลายทางพันธุกรรมของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 และ PV3.502        

 

ประชากรเชื้อ

ปี พ.ศ. 2553

ประชากรเชื้อ

ปี พ.ศ. 2556-2557

ประชากรเชื้อทั้งหมดและรวมทั้ง

สองเครื่องหมาย

PV3.27

PV3.502

รวม

PV3.27

PV3.502

รวม

 

จำนวนตัวอย่างที่วิเคราะห์

42

42

42

31

31

31

73

จำนวนอัลลีลที่แตกต่างกัน

12

12

-

14

13

-

-

ตัวอย่างที่มีการติดเชื้อมากกว่า

1 โคลน (ร้อยละ)

38.1

42.9

54.8

3.2

51.6

48.4

52.1

ค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้ (HE)

0.898

0.873

0.886 (0.012)

0.925

0.912

0.918 (0.006)

0.902 (0.011)

ค่าตัวเลขในวงเล็บคือค่า standard error

 

การทดสอบความแตกต่างทางพันธุกรรม

จากข้อมูลความถี่อัลลีล ค่า MOI และ ค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้ จะพบว่ามีความแตกต่างของลักษณะทางพันธุกรรมของประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 การทดสอบทางสถิติเพื่อทดสอบว่าความแตกต่างนี้มีนัยสำคัญทางสถิติหรือไม่ เนื่องจากเชื้อมาลาเรียระยะที่อยู่ในกระแสเลือดเป็นเชื้อระยะแฮพลอยด์ ดังนั้นการทดสอบความแตกต่างจะใช้ Shannon Analysis5,6 โดยใช้ Shannon’s mutual information index (SHUA) ซึ่งเป็นวิธีการวัดความแตกต่างระหว่างกลุ่มประชากร จาก SHUA สามารถเปลี่ยนเป็น log-likelihood contingency test G statistic ซึ่งเป็นสถิติไคสแควร์ที่ใช้ทดสอบความแตกต่างของความถี่อัล   ลีลของแต่ละคู่ของกลุ่มประชากร

เมื่อทดสอบด้วย Shannon Analysis พบว่าประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 มีการกระจายของอัลลีลแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ โดยที่เครื่องหมาย PV3.27 มีค่า G เท่ากับ 27.2, DF = 16, p = 0.039 เช่นเดียวกับเครื่องหมาย PV3.502 มีค่า G = 48.607, DF = 16, p<0.001 (ตารางที่ 4)

 

ตารางที่ 4      การวิเคราะห์ Shannon Analysis ของเครื่องหมาย PV3.27 และ PV3.502 สำหรับการเปรียบเทียบประชากร P. vivax ของปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 เปรียบเทียบทีละคู่

เครื่องหมาย

ประชากรเชื้อ

ในปี พ.ศ.

sHua

G

DF

p-value

2553

2556-7

PV3.27

42

31

0.186

27.200

16

0.039

PV3.502

42

31

0.333

48.607

16

<0.001

รวม

42

31

0.260

 

 

 

sHua: Shannon’s Mutual Information Index; G: G statistic

 

เมื่อศึกษาลักษณะของแฮปโพลไทป์ (haplotype) โดยใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ที่ตำแหน่ง PV3.27 และ PV3.502 ของทั้งสองกลุ่มประชากร P. vivax ในอำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรีพบมีแฮปโพลไทป์แตกต่างกัน 57 แฮปโพลไทป์ มี 14 แฮปโพลไทป์ที่พบมากกว่าหนึ่งครั้ง

 

วิจารณ์

การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความแตกต่างของลักษณะทางพันธุกรรมของเชื้อมาลาเรียชนิด P. vivax จากตัวอย่างเลือดผู้ป่วยติดเชื้อมาลาเรียในอำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรีเปรียบเทียบระหว่างปี พ.ศ. 2553 และ ปี พ.ศ. 2556-2557 การที่ต้องรวมผู้ป่วยในปี พ.ศ. 2556 และ 2557 เข้าด้วยกันเนื่องจากปัจจุบันจำนวนผู้ป่วยลดน้อยลงมาก การเก็บจำนวนตัวอย่างให้ได้ครบตามที่ต้องการภายในปีเดียวไม่สามารถทำได้จึงจำเป็นต้องเพิ่มระยะเวลาของการเก็บตัวอย่างไปถึงปี พ.ศ. 2557

เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์เป็นเครื่องมือที่สำคัญอย่างหนึ่งในการศึกษาความหลากหลายของประชากรเชื้อมาลาเรียชนิด P. vivax สามารถใช้ศึกษาวิวัฒนาการของเชื้อ การเคลื่อนย้ายประชากรเชื้อ และการติดเชื้อหลายสายพันธุ์พร้อม ๆ กัน การศึกษาครั้งนี้ผู้วิจัยใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์สองเครื่องหมายคือ PV3.27 และ PV3.502 ซึ่งอยู่บนโครโมโซมที่ 3 ของ P. vivax เป็นเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ที่มีการศึกษากันมาก มีผลการศึกษายืนยันว่า PV3.502 เหมาะกับการศึกษาความหลากหลายของประชากร และ PV3.27 เหมาะกับการศึกษาการติดเชื้อพร้อมกันหลายโคลน7 การที่ใช้เครื่องหมายที่มีผู้วิจัยอื่น ๆ ศึกษามาแล้วโดยใช้เชื้อมาลาเรียจากพื้นที่ต่าง ๆ กัน มีข้อดีคือสามารถเปรียบเทียบผลการศึกษาความหลากหลายและลักษณะทางพันธุกรรมของเชื้อมาลาเรียในพื้นที่ต่าง ๆ ที่มีมาลาเรียชุกชุม

 ลักษณะและความยาวของจำนวนซ้ำ (motif and repeat length) มีความสัมพันธ์กับความหลากหลายของเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์7 motif ที่มีความยาวมากกว่าจะมีความหลากหลายทางพันธุกรรมมากกว่า และ จำนวนเบสซ้ำที่มากกว่าก็จะมีความหลากหลายทางพันธุกรรมมากกว่าเช่นเดียวกัน ลักษณะการเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ของเครื่องหมาย PV3.502 คือ AACGGATG ซึ่งยาวกว่าการเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ของเครื่องหมาย PV3.27 คือ AAAC จากการศึกษานี้พบว่าความหลากหลายของประชากรเมื่อใช้เครื่องหมาย PV3.27 และ PV3.502 ให้ผลความหลากหลายใกล้เคียงกัน โดยพบว่าจำนวนอัลลีลต่อเครื่องหมาย PV3.27 มีจำนวนมากกว่าที่ตำแหน่ง PV3.502 เล็กน้อยคือเท่ากับ 14 และ 13 ตามลำดับ ค่าคาดหวังเฮเทอโรไซโกซิตี้ที่ตำแหน่ง PV3.27 ก็มากกว่าที่ตำแหน่ง PV3.502 เล็กน้อยคือเท่ากับ 0.925 และ 0.912 ตามลำดับ แต่ตัวอย่างที่มีการติดเชื้อมากกว่าหนึ่งโคลนเมื่อคำนวณจากตำแหน่ง PV3.502 มีค่ามากกว่าที่ตำแหน่ง PV3.27 คือพบร้อยละ 51.6 และ 38.1 ตามลำดับ

 

พื้นที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี จัดเป็นพื้นที่ที่มีมาลาเรียเป็นโรคประจำถิ่น การพบความหลากหลายทางพันธุกรรมของประชากร P. vivax สูงทั้งประชากรเชื้อปี พ.ศ. 2553 และ ปี พ.ศ. 2556-2557 จึงสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ที่พบว่าความชุกชุมของการแพร่เชื้อมาลาเรียในพื้นที่สอดคล้องกับการมีความหลากหลายของประชากรเชื้อมาลาเรีย7

ประชากร P. vivax เมื่อศึกษาด้วยเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 และ PV3.502 มีความหลากหลายสูง เมื่อใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 หรือ PV3.502 อย่างใดอย่างหนึ่งเพียงอย่างเดียว พบว่าเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.502 ทำให้ตรวจพบความหลากหลายได้มากกว่าและทำให้เห็นความแตกต่างของประชากร P. vivax ในปี พ.ศ. 2553 และ ปี พ.ศ. 2556-2557 ได้มากกว่า

การศึกษานี้พบว่าอัตราการติดเชื้อแบบหลายโคลนเท่ากับร้อยละ 52.1 ซึ่งต่ำกว่าการศึกษาของ Imwong และคณะในปี ค.ศ. 20073 ซึ่งเท่ากับร้อยละ 66 เล็กน้อย การที่มีอัตราการพบเชื้อซ้ำพร้อมกันหลายโคลนน้อยกว่าอาจเกิดจากการที่ใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไทล์เพียงสองตำแหน่ง ในขณะที่ของ Imwong และคณะใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ถึง 9 ตำแหน่ง นอกจากนี้การศึกษาของ Imwong และคณะไม่ได้กล่าวถึงว่าตัวอย่างเป็น P. vivax จากจังหวัดใดของประเทศไทย

การค้นพบที่สำคัญที่สุดในการศึกษานี้คือการพบว่าประชากร P. vivax ที่พบในปี พ.ศ. 2553 และปี พ.ศ. 2556-2557 ที่อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี มีความแตกต่างกันทางพันธุกรรมเมื่อศึกษาด้วยเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ PV3.27 และ PV3.502 ความแตกต่างนี้อาจอธิบายการที่พบ P. vivax ในพื้นที่นี้เพิ่มมากขึ้น จนมีสัดส่วนชนิดเชื้อสูงกว่าเชื้อมาลาเรียชนิด P. falciparum อย่างไรก็ตาม นอกจากปัจจัยทางด้านพันธุกรรมของเชื้อ P. vivax แล้ว ก็ยังไม่สามารถตัดประเด็นเรื่องความสำเร็จของการรักษาผู้ป่วยมาลาเรียชนิด P. falciparum ได้ด้วยยาที่มีประสิทธิภาพสูงกลุ่มอนุพันธ์อาร์ติมิซินิน ซึ่งทำให้สัดส่วนของผู้ป่วยมาลาเรียชนิด P. falciparum ลดน้อยลง

การที่มีการแพร่เชื้อสูง การมีเชื้อที่ซ่อนอยู่ในตับที่ทำให้เชื้อกลับซ้ำชนิดรีแลปส์ และการมีภูมิคุ้มกัน เป็นสาเหตุทำให้ผู้ติดเชื้อมีการติดเชื้อแบบหลายโคลน8 การเกิด sexual recombination จะเกิดได้ในยุงที่ได้เชื้อระยะแกมมีโตไซต์ (gametocyte) ของเชื้อต่างโคลนกัน ซึ่งมีโอกาสเกิดได้มากถ้ายุงกินเลือดจากผู้ที่ติดเชื้อหลายโคลน ยุงพาหะมาลาเรียอาจมีเชื้อมาลาเรียหลายโคลนในตัวเดียวกันซึ่งสามารถแพร่เชื้อมาลาเรียหลายโคลนนี้พร้อมกันเมื่อกัดคนแม้เพียงครั้งเดียว8, 9

เป็นที่ทราบกันดีว่าเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์เป็นเครื่องมือที่ดีในการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมเพราะมีความผันแปรสูง มีความจำเพาะต่อตำแหน่ง และไม่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันของโฮสต์10 ผลการศึกษานี้พบว่าแม้จะใช้เครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์เพียงสองตำแหน่งคือ PV3.27 และ PV3.502 ก็สามารถบอกความแตกต่างของเชื้อมาลาเรียที่เกิดขึ้นในช่วงเวลาต่างกันได้  ข้อมูลนี้เป็นข้อมูลพื้นฐานเพื่อใช้ทำแผนที่แสดงระบาดวิทยาของ P. vivax ในจังหวัดกาญจนบุรี และสามารถใช้สร้างโมเดลเพื่อทำนายแหล่งกำเนิดของ P. vivax ได้เมื่อมีการศึกษาต่อเนื่องต่อไป ข้อมูลโครงสร้างพันธุกรรมของเชื้อมาลาเรียนี้จะมีประโยชน์เมื่อมีการระบาดของโรคมาลาเรียและต้องการหาแหล่งกำเนิดของเชื้อมาลาเรียที่กลับมาใหม่ในพื้นที่ วิธีนี้สามารถใช้เพื่อสนันสนุนวิธีการทางระบาดวิทยาเพื่อการป้องกันและควบคุมโรคมาลาเรีย

 

กิตติกรรมประกาศ

การวิจัยครั้งนี้จะประสบความสำเร็จไม่ได้เลยหากไม่ได้รับความอนุเคราะห์จากคุณวิทยา สายพรมสุด หัวหน้าหน่วยควบคุมโรคติดต่อนำโดยแมลงที่ 4.1.4 ตำบลลุ่มสุ่ม อำเภอไทรโยค จังหวัดกาญจนบุรี และเจ้าหน้าที่มาลาเรียคลินิกที่ช่วยเหลือในการเก็บรวบรวมตัวอย่างเลือดผู้ป่วยมาลาเรียที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้

ขอขอบคุณ นางสาววิรัชดา ศิริรัตน์ นิสิตสาขาวิชาเทคนิคการแพทย์ คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏบ้านสมเด็จเจ้าพระยา ที่ช่วยงานห้องปฏิบัติการโมเลกุล  สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์การแพทย์ทหารฝ่ายสหรัฐ(AFRIMS) ที่ให้ความอนุเคราะห์เครื่องมือ วัสดุ และ อุปกรณ์ที่ใช้ในการปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการโมเลกุล และมหาวิทยาลัยราชภัฏบ้านสมเด็จเจ้าพระยาที่ให้การสนับสนุนเงินทุนสำหรับการศึกษาครั้งนี้

 

เอกสารอ้างอิง

1.     สำนักโรคติดต่อนำโดยแมลง. สถานการณ์โรคมาลาเรีย. ใน: นิพนธ์ ชินานนท์เวช, บรรณาธิการ. รายงานประจำปี 2557. กรุงเทพ ฯ : สำนักพิมพ์อักษรกราฟฟิคแอนด์ดีไซน์, 2557: 15-19.

2.     Congpuong K, Satimai W, Sujariyakul A, Intanakom S, Harnpitakpong W, Pranuth Y, et al. In vivo sensitivity monitoring of chloroquine for the treatment of uncomplicated vivax malaria in four bordered provinces of Thailand during 2009-2010. J Vector Borne Dis 2011; 48: 190-6.

3.     Imwong M, Nair S, Pukrittayakamee S, Sudimack D, Williams JT, Maysay M, et al. Contrasting genetic structure in Plasmodium vivax populations from Asia and South America. Int J Parasitol 2007; 37: 1013-22.

4.     Peakall R, Smouse PE. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update. Bioinformatics 2012; 28: 2537-39.

5.     Sherwin WB, Jabot F, Rush R, Rossetto M. Measurement of biological information with applications from genes to landscapes. Mol Ecol 2006; 15: 2857-69.

6.     Rossetto M, Kooyman R, Sherwin WB, Jones R. Dispersal limitations, rather than bottlenecks or habitat specificity; can restrict the distribution of rare and endemic rainforest trees. Amer J Bot 2008; 95: 321-9.

7.     Sutton PL. A call to arms: on refining Plasmodium vivax microsatellite marker panels for comparing global diversity. Malar J 2013; 12: 447.

8.     Koepfli C, Ross A, Kiniboro B, Smith TA, Zimmerman PA, Siba P, et al. Multiplicity and diversity of Plasmodium vivax infections in a highly endemic region in Papua New Guinea. PLOS Negl Trop Dis 2011; 5: e1424.

9.     Babiker HA, Ranford-Cartwright LC, Currie D, Charlwood J., Billingsley P, Teuscher T, et al. Random mating in a natural population of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Parasitology 1994; 109: 413-21.

10.   Gunawardena S, Kaurnaweera ND, Ferreira MU, Phone-Kyaw M, Pollack RJ, Alifrangis M, et al. Geographic structure of Plasmodium vivax: microsatellite analysis of parasite populations from Sri Lanka, Myanmar, and Ethiopia. Am J Trop Med Hyg 2010; 82: 235-42.

 

 

Untitled Document
Article Location

Untitled Document
Article Option
       Abstract
       Fulltext
       PDF File
Untitled Document
 
ทำหน้าที่ ดึง Collection ที่เกี่ยวข้อง แสดง บทความ ตามที่ีมีใน collection ที่มีใน list Untitled Document
Another articles
in this topic collection

Incidence of Positive Culture form Catheter Tip after Endotracheal Tube Suctioning Uning Disposable VS. Sterilized Reusable Gloves (การศึกษาเปรียบเทียบอัตราการเพราะเชื้อได้ผลบวกจากปลายสายดูดเสมหะจากท่อช่วยหายใจเมื่อใช้ถุงมือปราศจากเชื้อในห้องผ่าตัดโรงพยาบาลศรีนครินทร์)
 
Enterotoxins, TSST-1 Production and Drug Semsitivity Of Staphyrococcus aureus Isolated from Hospital Staffs And Medical Student in Srinagarind Hospital (Enterotoxins, Toxic shock syndrome toxin- 1 และความไวต่อยาของเชื้อ Staphylococcus aureus ที่แยกจากบุคลากรโรงพยาบาลและนักศึกษาแพทย์ โรงพยาบาลศรีนครินทร์ )
 
Diarrhea due to Vibrio cholera 0139 in Srinagarind Hospital (โรคอุจจาระร่วงอย่างแรงจากเชื้อ Viabrio cholera 0139ในโรงพยาบาลศรีนครินทร์ )
 
Ebola Virus (อีโบลา)
 
<More>
Untitled Document
 
This article is under
this collection.

Microbiology
 
 
 
 
Srinagarind Medical Journal,Faculty of Medicine, Khon Kaen University. Copy Right © All Rights Reserved.
 
 
 
 

 


Warning: Unknown: Your script possibly relies on a session side-effect which existed until PHP 4.2.3. Please be advised that the session extension does not consider global variables as a source of data, unless register_globals is enabled. You can disable this functionality and this warning by setting session.bug_compat_42 or session.bug_compat_warn to off, respectively in Unknown on line 0